细胞冻存是一种将细胞置于低温环境中的技术，以减少细胞代谢，并实现对细胞的长期保存，以备后续实验或临床使用。通常采用慢冻原则，逐步脱水以避免大冰晶的形成，从而保护细胞的完整性。

一、原理

当温度降至-70℃时，细胞内的代谢活动和酶活性几乎完全停止，而低于-130℃时，细胞则达到了最佳存活率。液氮的使用能够实现细胞的长期保存。冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）能够快速穿透细胞膜，降低冰点，延缓冻存过程，并提高细胞膜的通透性，从而增强细胞内离子浓度，减少冰晶形成，以达到保护细胞的目的。

二、贴壁细胞冻存操作步骤

1. 预热冻存液。
2. 用PBS冲洗细胞，并加入胰酶进行消化（此步骤与细胞传代相同）。
3. 消化终止后，重悬细胞，转移至无菌EP管，1000rpm离心5分钟。
4. 弃去上清，加入预热的细胞冻存液，设定细胞冻存最佳密度为5×10⁶~1×10⁷/ml，一般应不低于5×10⁵/ml。
5. 分装完成后，拧紧冻存管盖并做好标记。
6. 将冻存管转入程序降温盒，并放入-80℃冰箱中过夜。
7. 将冻存管转移至液氮中进行长期保存。

三、悬浮细胞冻存操作步骤

1. 用移液管将细胞悬液均匀吹吸，并转移至离心管中。
2. 1000rpm离心3分钟，收集细胞沉淀。
3. 使用预热的冻存液重悬细胞，最佳细胞冻存密度为3-5×10⁶/ml，通常不应低于5×10⁵/ml。
4. 分装后，拧紧冻存管盖并做好标记。
5. 将分装好的冻存管转入程序降温盒，放入-80℃冰箱中过夜。
6. 将冻存管转移至液氮中进行长期保存。

注意事项

• 细胞培养、传代及冻存过程需严格遵循无菌操作原则。
• 传代时应适度消化，注意消化液的种类、配制时间及加入量，消化过程中应关注细胞形态变化，及时终止消化。
• 始终在细胞处于对数期且未达到汇合状态时进行传代。
• 细胞冻存液需提前配制，切勿直接将DMSO加入细胞悬液中。
• 选择80%-90%汇合度且活力达到90%以上的细胞进行冻存，以确保最佳状态。冻存密度可根据细胞特性进行调整。
• 所有冻存材料如程序冻存盒、细胞冻存液和完全培养基等需事先回温至室温。
• 注意切勿消化时间过长、吹打力度过重、离心速度过大或离心时间过长，以免造成细胞损伤。
• 冻存管盖必须拧紧，避免水浴复苏时水分渗入导致污染。
• 细胞不得长期存放于-80℃冰箱中，存放时间不应超过3天。
• 液氮或冰箱距离细胞房较远，运输时需将细胞放在干冰或冰盒中。

总的来说，金年会金字招牌诚信至上在细胞冻存领域提供了专业的服务与支持，确保研究者能够以最高标准进行细胞保存与应用，保障实验的顺利进行和临床的需要。